白癜风PCR-SSP技术检测多发性硬化HLA-DRB1等位基因的临床应用探讨
PCR-SSP技术检测多发性硬化HLA-DRB1等位基因的临床应用探讨
PCR-SSP技术检测多发性硬化HLA-DRB1等位基因的临床应用探讨
中国神经精神疾病杂志 2000年第5期第26卷 论著与学术交流
作者：李善宗 胡学强
单位：李善宗（中山医科大学附属第一医院神经科 510080）；胡学强（中山医科大学附属第三医院神经科）
关键词： 序列特异性引物；人类白细胞抗原；基因分型 多发性硬化
【摘要】 目的 探讨序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)联合技术对广东地区多发性硬化(multiple sclerosis, MS)患者HLA-DRB1等位基因检测的临床价值。方法 运用PCR-SSP对45例病例组和105例正常对照组进行HLA-DRB1基因分析。结果 PCR-SSP具有高度敏感、特异性、重复性好，快捷、高效等特点，并发现广东地区MS患者与HLA-DR2基因相关联。结论 PCR-SSP在研究MS分子免疫遗传学机制上有其临床应用价值。;
多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统常见的自身免疫炎症脱髓鞘疾病，以多发性病灶及缓解与复发病程为特征，其病因及发病机制未明。近年，我国MS的发病有上升趋势。本文运用序列特异性引物-聚合酶链反应(sequence specific primers, PCR-SSP)联合技术对广东地区45例MS患者和105例正常健康者进行人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)DRB1基因与MS遗传易感性研究，为临床早期诊断、疾病相关分析及病情预后判断提供初步的实验技术手段。
1 资料和方法
1.1 研究对象 参照1983年Poser［1］临床诊断标准。病人组系1996～1998年我院神经科住院及门诊的广东地区汉族MS患者45例，男18例，女27例，年龄18～55岁，平均34.8岁。对照组系医院血库提供的广东地区健康汉族105例血标本，男50例，女55例，年龄20～51岁，平均32.5岁。
1.2 序列特异性引物 采用美国G&T公司HLA-DR分型混合引物共9组，每组混合两对以上引物，含产生429 bp内参照的内对照引物，其中DR2、DR3、DR5、DR6又可细分为DR15和16、DR17和18、DR11和12、DR13和14(见表1)，采用梯度间距为100 bp的DNA分子量标准。
1.3 DNA抽提 按John等［2］报道的NP-40破裂法进行部分改良，并与传统酚法相比较。
1.4 HLA-DRB1基因特异性扩增及检测 PCR采用双温热循环，循环参数为：95℃预变性5 min后，94℃变性30 s，58℃退火30 s，共35次循环，最后72℃延伸5 min，采用质量浓度为0.02的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，溴乙锭染色后置紫外仪观察。
2 结果
2.1 基因组DNA提取 NP-40破裂法抽提全部样本DNA经紫外分光光度计检测，浓度达0.2～0.5 μg/μL(OD260×稀释倍数×50/1000),纯度达1.3～1.6(OD260/OD280),完全能满足PCR扩增要求。
2.2 PCR-SSP扩增检测 每个样本在分别加有1～9组HLA-DR分型混合引物的9个反应管中同时进行9个独立的PCR特异性扩增反应，由于每个个体均携带分别来自父方和母方的两条HLA单倍体，多数为杂合子，故正常情况应出现两条不同的特异性扩增带，在有阳性内参照出现的条件下根据产生特异性扩增条带相对应的组序列特异性引物所扩增产物片段大小及其确定的等位基因型别(参见表1)，参照梯度为100 bp的DNA分子量标准(marker)直接读出特异性扩增带的结果(见图1)。
表1 特异性混合引物相应的PCR扩增产物片段大小及其
确定的HLA-DR基因型别和等位基因
HLA-DR分型
混合引物
扩增片段
大小(bp)
基因型
等位基因
DRMix1
255
DR1
DRB1*01
207
DR10
DRB1*10
DRMix2
197
DR15(2)
DRB1*15
214
DR16(2)
DRB1*16
DRMix3
217
DR17(3)
DRB1*0301
189
DR18(3)
DRB1*0302,0303
DRMix4
260
DR4
DRB1*04
DRMix5
176
DR11(5)
DRB1*11
248
DR12(5)
DRB1*12
DRMix6
130
DR13(6)
DRB1*13
224
DR14(6)
DRB1*14
DRMix7
232
DR7
DRB1*07
DRMix8
214
DR8
DRB1*08
DRMix9
236
DR9
DRB1*09
图1 MS病人HLA-DRB1基因PCR-SSP分型电泳结果为DR18/12
从图1可见，电泳凝胶上共有“M～9”标记的10个泳道，“M”泳道为梯度100 bp的DNA分子量标准，按图示最前的为100 bp，随后依次为200 bp、300 bp、 400 bp，依此类推，而400 bp之后“1～9”个泳道均出现了429 bp的阳性内参照条带，说明整个反应体系及反应过程都是正常的，而“3”和“5”泳道出现了特异性扩增条带，两者片段大小分别位于100～200 bp和200～300 bp之间，分别由确定DR3和DR5等位基因的3组和5组序列特异性引物扩增所得，参照表1，此样本基因型为DR18/12。
3 讨论
事实表明，暴露于相同环境的人群只有小部分患MS，对于这部分人即使一次很轻微的感冒也可能促发或使已缓解的MS复发，说明MS发病很大程度取决于个体的遗传背景；流行病学及家系调查和双生子研究［3～5］也说明MS具有一定的遗传易感性；免疫应答基因异常很可能是造成MS发病的遗传基础。位于人类第6号染色体短臂6P2105区带的HLA复合体属于免疫应答基因，在人类适应大自然长期进化过程中由于基因区核苷酸序列的高度变异而具有高度多态的特性，在机体免疫调控过程中发挥极其重要的作用。研究发现，机体器官特异性自身免疫性疾病的靶细胞可有HLA Ⅱ类抗原的异常表达，疾病若与HLA Ⅱ类基因尤其是HLA-DR关联可有自身免疫调节障碍，表现为慢性复发病程、炎症性质、免疫功能异常及遗传倾向［6］，MS具有这些特点。HLA作为人类一种较好的遗传标记，被广泛用于疾病遗传易感性研究。
以往多采用基于HLA抗原性不同的血清学或混合淋巴细胞培养法，通过检测基因表达产物进行HLA分型，但由于标准单抗来源不易，加上细胞表达能力低，存在交叉反应等缺陷，该法被目前的基因分型法所取代。PCR-RFLP可特异性扩增酶切片段，但酶切图谱复杂；PCR-SSO分辨率虽高，但探针昂贵、操作繁琐；PCR-SSP是利用Taq酶缺乏3′-5′端外切酶活性的特点，设计序列特异性引物(SSP)与模板DNA，3′端碱基不互补时会引起Taq酶延伸作用因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，再经凝胶电泳检测扩增带来分析HLA的等位基因型别。
该法对HLA-DRB1基因分型有其独特之处：①序列特异性引物只对特定基因片段高倍扩增，引物设计越精密，分型就越细致，其特异性强、分辨率高；②影响因素少，只要控制模板DNA和引物等反应体系的质量及热循环条件，每个样本均能正确分型，加上每管反应均有阳性内参照客观指示PCR的正常进行，其准确性高、重现性好；③NP-40破裂法对DNA进行快速抽提，无需蛋白酶消化，抽提质量与传统酚法相差无几，耗时仅需1.5小时；④快速混合加样将反应体系相同组分包括引物、Buffer、dNTP、Taq酶、溴酚蓝指示剂按需要量先配制成反应液，分装于确定相应DR基因型别的9个反应管中，反应前只需每管加入模板DNA，稍作离心即可热循环；⑤因扩增产物片段小，无需每一循环都延伸，双温循环耗时仅1.5小时，加上电泳、照相记录等总耗时约4小时，根据反应管容积大小(0.2 mL,0.5 mL)，一次可同时多个样本参与PCR反应，充分体现出高效、快捷的优点，利于临床检测，并有朝着自动化方向发展的趋势，有较好的应用前景。
参考文献
1，Poser CM, Paty DW, Scheinbery L, et al. New diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines for research pro-tocols. Ann Neurol, 1983, 13(3): 227
2，John SWM, Weitzner G, Rozen R, et al. A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes. Nucleic Acid Res, 1991, 19(2):408
3，Sadovnick AD, Baird PA. The familial nature of multiple sclerosis: Age-corrected empiric recurrence risk for children and silblings of patients. Neurology, 1988, 38(6):990
4，Sadovnick AD, Bulman DE, Ebers GC. Parent-child concordance in multiple sclerosis. Ann Neurol, 1991, 29(3):252
5，Eber GC, Bulman DE, Sadovnick AD, et al. A population based study of multiple sclerosis in twins. N Engl J Med, 1986, 315(25):1638
6，孙圣刚，童萼塘. 多发性硬化病因和发病机理的研究进展. 临床神经病学杂志，1995，8(1)：5
